Impact multi-échelle de l’édition épigénétique chez les plantes : de la dynamique de la chromatine au destin cellulaire

Résumé :

Chez les plantes comme chez les animaux, le Complexe Répressif Polycomb 2 (PRC2), qui appose des marques de méthylation sur la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me3), réprime des milliers de gènes du développement, assurant ainsi les transitions successives du cycle de vie de la plante. Savoir si la marque H3K27me3 elle-même joue un rôle dans la répression génique reste une question ouverte. Pour y répondre, il faut des outils permettant de supprimer ou d’apposer cette marque, contournant ainsi les conséquences pléiotropiques et souvent létales des mutations des sous-unités du PRC2. L’objectif de ma thèse est de développer et d’évaluer des stratégies complémentaires de manipulation de H3K27me3 chez Arabidopsis thaliana, et de les associer à l’imagerie en super-résolution de la chromatine in situ. Le premier chapitre passe en revue l’état de l’art sur la composition et le recrutement du PRC2 chez les plantes, les processus développementaux régulés par Polycomb, et la boîte à outils émergente pour l’ingénierie de la chromatine : remplacement d’histones, Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) et nanocorps. Le deuxième chapitre explore l’inhibition chimique du PRC2 comme moyen dose-dépendant, réversible et non transgénique de réduire les niveaux de H3K27me3. Si cette approche offre un contrôle temporel que la déplétion génétique n’atteint pas facilement, elle soulève des questions d’absorption, de stabilité et d’activité hors cible, qui sont abordées. Le troisième chapitre présente une approche basée sur les nanocorps pour introduire une activité de déméthylase H3K27me3 dans la chromatine à l’échelle du génome, indépendamment de la séquence d’ADN. Des lignées constitutives et inductibles par la dexaméthasone ont été générées en parallèle de lignées témoins portant une version catalytiquement inactive du domaine déméthylase, afin de distinguer les conséquences de la déméthylation de celles de la simple liaison à la chromatine. Les lignées exprimant la fusion active ont convergé vers un ensemble cohérent de phénotypes au fil des générations : floraison précoce et anomalies homéotiques florales comparables à celles du mutant prc2 nul curly leaf, développement racinaire altéré, viviparité et structures embryonnaires ectopiques dans les graines en développement. Cependant, la quantification globale de H3K27me3 n’a pas permis de distinguer clairement les lignées actives des lignées non actives. Le quatrième chapitre présente la méthodologie publiée que j’ai mise au point pour analyser la chromatine par imagerie à super-résolution sur des noyaux isolés de plantules. Ce protocole de microscopie de localisation de molécules individuelles adapté aux noyaux d’Arabidopsis, de la préparation des échantillons à l’acquisition d’images, a ensuite été appliqué à la visualisation conjointe de H3K27me3 et de l’ADN, afin de fournir une lecture nanométrique des modifications épigénomiques que les analyses globales tendent à lisser. Enfin, le cinquième chapitre présente une étude publiée à laquelle j’ai contribué, fondée sur une déméthylation spécifique d’un locus, complémentaire du ciblage à l’échelle du génome. La déméthylation de H3K27me3 médiée par dCas9 et ciblée sur le gène « frontière » CUC3 y déclenche une transcription ectopique et altère le développement, démontrant que la perte locale de la marque à un seul locus suffit à affecter l’expression génique et la morphogenèse végétale. Dans l’ensemble, ces résultats apportent de nouveaux outils et des avancées méthodologiques ouvrant de nouvelles voies pour élucider la fonction réelle de H3K27me3 dans la transcription génique et la morphogenèse végétales, et devraient permettre d’étudier le rôle causal des marques chromatiniennes en reliant leur dynamique aux réorganisations nanométriques au sein du noyau.

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